本發明涉及納米醫學、生物材料及核酸藥物遞送領域，更具體地涉及一種仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸及其實現長循環與快速腎清除的應用。
背景技術：
1、納米藥物向臨床轉化過程中長期面臨一項根本性的藥代動力學悖論：延長體內循環時間的設計策略，往往同時阻斷了對安全性至關重要的清除通路。這一問題的本質源于界面設計層面的局限，即在分子尺度上難以實現對空間位阻效應與水動力學尺寸的獨立調控。
2、peg?修飾（pegylation）作為當前最成熟的隱身化策略，其優化主要局限于化學參數層面，例如調節?peg?分子量或接枝密度。此類方法雖然可以改變界面“屏障密度”，但無法精確控制聚合物鏈在生物–納米界面處的三維空間構象，最終不可避免地將隱身效果與尺寸增大耦合在一起，從而阻礙腎臟清除。
3、要突破這一限制，亟需一種同時具備原子級結構精度和空間可尋址性的平臺，以實現對界面構象的可編程調控。dna?納米技術憑借其高度的結構剛性與精確的序列可編程性，天然滿足這一需求，并提供了理想的構建骨架。例如，dna?四面體等幾何結構為界面構象工程提供了明確的空間坐標體系。
4、因此，亟需一種新的納米載體設計策略，在保證良好血液循環性能的同時，實現快速且高效的腎臟清除。
技術實現思路
1、本發明的目的是提供一種仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸及其實現長循環與快速腎清除的應用，從而解決現有?peg?化核酸遞送載體中長循環與快速腎清除難以兼顧的矛盾，以及?peg?修飾導致尺寸過大、難以通過腎小球濾過的問題。
2、為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：
3、根據本發明的第一方面，提供一種仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸，以dna?四面體框架為骨架，在組成該dna?四面體框架的4條dna?單鏈序列中周期性地引入peg?單元，通過?dna?自組裝技術與堿基互補配對原則一步退火組裝，使?peg?分子在dna四面體框架的每一條棱上周期性分布，形成仿髓鞘的三維?peg?網絡包覆結構；所述三維peg?網絡包覆結構實現空間構象與水動力學尺寸的獨立調控，在不顯著增大小分子尺寸的前提下形成致密的空間位阻屏障。
4、根據本發明，該仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸的水動力學直徑維持在7nm±0.5nm，表面負電荷顯著降低，血清蛋白吸附量降低?60%?以上，且能顯著抑制?dnasei?對?dna?框架的降解。
5、根據本發明的一個優選方案，所述?dna?四面體框架的?4?條?dna?單鏈可設計為每條鏈含多個三乙二醇單元（-3peg-）。應當理解的是，“-3peg-”指在dna鏈上的左右兩個核苷酸的磷酸骨架之間插入3個乙二醇分子，其設計目的是用這一系列插入3peg的dna鏈組裝形成一種peg在四面體上呈空間分布的結構。
6、根據本發明的一個最優選方案，所述?dna?四面體框架的每條鏈含?6?個“-3peg-”單元，總?peg?修飾位點可達到?24?個，形成限域空間內的乙二醇分子三維分布結構。
7、根據本發明的研究發現，隨著peg修飾在四面體上修飾維度的升高，其對四面體的物理化學性質和生理特性會產生不同的影響，導致其在生物體內表現出不同的代謝特性。在相同分子量下，peg在三維空間內的分散分布能夠在維持其分子功能的情況下降低納米顆粒尺寸，同時屏蔽電荷。
8、根據本發明的第二方面，提供一種所述仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸的制備方法，包括以下步驟：
9、s1、合成含?3peg?分子的?dna?單鏈：合成?4?條?dna?單鏈，各?dna?單鏈上均設計有周期性排布的?3peg?插入位點，且各插入位點處均直接插入?3peg?分子；
10、s2、退火組裝：將步驟?s1?所得?4?條含?3peg?分子的?dna?單鏈按等摩爾比例混合，使每條鏈終濃度為?4~6μm，置于?1×tae/mg2+緩沖液中經?95℃保溫?4~6min?后迅速冷卻至?4℃，一步退火組裝得到所述仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸。
11、優選的，還包括步驟s3：在所述四面體框架核酸的頂點設置捕獲鏈，將其與capture-clone?9?鏈在室溫下靜置?0.5~1.5h?雜交，實現與膽汁酸特異性核酸適配體的偶聯。
12、優選的，步驟?s2?中，所述?1×tae/mg2+緩沖液的組成為：40mm?tris、2mm?edta·2na·2h2o、20mm?醋酸、12.5mm?醋酸鎂，ph8.2。
13、根據本發明的第三方面，提供一種所述仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸在制備實現體內長循環與快速腎清除的核酸藥物遞送載體中的應用。
14、根據本發明研究發現，所述仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸作為核酸藥物遞送載體時，在小鼠體內的血液循環半衰期較未修飾?tdf?延長約?2?倍，4?小時內經腎臟清除比例超過?90%，24h?累積腎臟排泄率達?90%?以上，且在動物體內主要臟器中無明顯組織損傷，具備良好的生物相容性與體內安全性。
15、根據本發明，將所述仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸與功能性核酸適配體偶聯，作為負載功能性核酸適配體的核酸藥物遞送載體，在實現長循環與快速腎清除的同時，通過核酸適配體實現對靶標物質的特異性識別與結合，將靶標物質通過腎臟途徑快速排出體外。
16、根據本發明的一個優選方案，所述功能性核酸適配體為膽汁酸特異性核酸適配體clone?9，其核苷酸序列為：gcagggtcaatggaattaatgatcaattgacagacgcaagtct；通過在三維peg?修飾的dna?四面體框架的頂點設置的捕獲鏈與?capture-clone?9?鏈雜交實現與clone?9?的偶聯，所述?capture-clone?9?鏈的核苷酸序列為：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcagggtcaatggaattaatgatcaattgacagacgcaagtct。
17、根據本發明提供的一種應用，所述核酸藥物遞送載體用于制備治療因體內靶標物質蓄積引發的疾病的核酸藥物，尤其適用于制備治療高膽汁酸血癥的核酸藥物，可通過單次或多次給藥模式，高效捕獲血液中的游離膽汁酸并經尿液途徑快速排出，顯著降低血清膽汁酸水平。
18、根據本發明的一個優選方案，提供一種仿髓鞘三維?peg?修飾的四面體框架核酸及其實現長循環與快速腎清除的應用，包括如下步驟：
19、1）四面體框架核酸的制備，利用dna自組裝技術與堿基互補配對原則，使用特定序列的dna單鏈合成tdf以及在不同維度上修飾peg分子，并通過凝膠電泳和原子力顯微鏡（afm）表征結構；
20、2）分別利用熒光分子定量和熒光共振能量轉移（fret）手段對peg修飾位點進行定性和定量分析，從而驗證peg修飾的不同tdf的組裝結構；
21、3）通過分子動力學模擬對設計組裝成的tdf進行結構動態模擬，同時模擬其表面靜電勢，檢測各tdf在pbs環境中的粒徑和ζ電位，并與模擬結構進行對比分析；
22、4）通過磁珠分選、蛋白定量以及石英晶體微天平檢測tdf表面吸附的蛋白水平，同時檢測各tdf在dnase?i的環境下的降解速率；
23、5）利用熒光分子標記peg修飾的tdf，在小鼠內動態監測血液濃度變化和尿液含量綜總和，計算其在生理狀態下的血液循環時間和累計腎臟清除率，并統計tdf在各器官中分布水平；
24、6）構建小鼠高膽汁酸血癥模型，利用tdf-peg3負載膽汁酸特異性核酸適配體clone?9，通過單次與多次注射評估其對膽汁酸的清除作用，并探索其攜帶膽汁酸的清除途徑。
25、根據本發明，提供一種受髓鞘啟發的fna三維peg修飾實現長循環與快速腎清除的應用，其協同調控示意圖如圖1所示，受包裹軸突的髓鞘所具有的周期性結構啟發，在?dna四面體納米結構的每一條棱上周期性地引入?peg?單元，從而構建出一種三維?peg?修飾的框架核酸（fna）；三維?peg?化在血管內提供了有效的保護屏障，顯著降低了其對酶促降解和吞噬細胞攝取的敏感性。同時，該三維?peg?修飾的?fna?表現出更小的水動力學尺寸和更低的表面電荷，從而能夠高效、快速地通過腎小球濾過屏障實現血液循環中的清除。
26、本發明受髓鞘結構啟發：該生物體系通過緊密的多層螺旋構型，在不顯著增加徑向體積的前提下實現高效軸向隔離，因此本發明重新定義了peg?鏈的角色，將其從被動的表面修飾物，轉變為主動的結構構件。通過在?dna?框架上精確指定?peg?的三維排列方式，模擬髓鞘的“拓撲壓縮”原理，從而在界面層面實現隱身性與尺寸的解耦。
27、本發明的關鍵發明點主要體現在以下幾個方面：結構設計創新：突破了傳統?peg被動表面修飾的思路，將?peg?鏈作為主動結構構件，通過仿髓鞘的三維拓撲化設計，在dna?四面體框架（tdf）的棱上周期性引入?peg?單元，構建出三維網絡化的?peg?包覆結構，而非簡單的線性或平面修飾。性能解耦突破：通過“拓撲壓縮”原理，實現了空間位阻效應與水動力學尺寸的獨立調控。在不顯著增大載體尺寸（維持在約?7nm）的前提下，形成了致密的空間位阻屏障，成功解耦了長循環與快速腎清除這兩個在傳統?peg?化載體中相互矛盾的性能需求。應用場景精準：將該三維?peg?修飾的?tdf?與膽汁酸特異性核酸適配體偶聯，開發出可高效捕獲并快速清除血液中游離膽汁酸的遞送載體，為高膽汁酸血癥等靶標物質蓄積相關疾病提供了全新的治療策略。
28、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
29、1）顯著降低蛋白吸附與酶降解：三維?peg?網絡能夠在?dna?四面體表面形成致密而連續的空間位阻屏障，使血清蛋白吸附量降低?60%?以上，并顯著抑制?dnase?等核酸酶對?dna?框架的降解。
30、2）同時實現長循環與快速清除：本發明的三維?peg?修飾框架核酸在小鼠體內可使血液循環半衰期延長約?2?倍，同時在?4?小時內經腎臟清除比例超過?90%，有效解決了長循環與清除效率之間的傳統矛盾。
31、3）維持較小水動力學尺寸與低表面電荷：由于?peg?被限制在三維空間內形成“拓撲壓縮”構象，本發明體系的水動力學直徑維持在約?7.2?nm，且表面負電荷顯著降低，從而更易通過腎小球濾過屏障。
32、4）具有良好生物相容性與安全性：動物實驗結果表明，本發明所述?peg?修飾?dna框架在主要臟器中未引起明顯組織損傷，具有良好的體內安全性。
33、綜上所述，本發明以?dna?四面體框架（tdf）為可編程骨架，通過在其每一條棱上周期性引入peg單元，將?peg?鏈作為主動結構構件而非被動表面修飾物，構建仿髓鞘的三維拓撲化?peg?網絡包覆結構；該技術方案突破了傳統?peg?化核酸遞送載體長循環與快速腎清除難以兼顧的瓶頸，在不顯著增大小分子尺寸（水動力學直徑維持在約?7nm）的前提下，形成致密的空間位阻屏障，顯著降低血清蛋白吸附與核酸酶降解，同時高效通過腎小球濾過屏障，在小鼠體內實現了血液循環半衰期延長約?2?倍、4?小時內經腎臟清除比例超過90%?的協同效應，且具備良好的生物相容性與體內安全性，尤其適用于負載膽汁酸特異性核酸適配體等功能性分子，為高膽汁酸血癥等靶標物質蓄積相關疾病提供了高效、安全的核酸藥物遞送新策略。