一種蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體及其在制備降尿酸制品中的應用

本發明涉及生物，具體涉及一種蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體及其在制備降尿酸制品中的應用。

背景技術：

1、高尿酸血癥是由尿酸生成與排泄失衡導致的代謝異常狀態。尿酸是嘌呤代謝的終產物，黃嘌呤氧化酶（xod）在尿酸生成過程中起關鍵催化作用，因此抑制xod活性可作為降尿酸活性評價和篩選的重要依據。

2、蝦青素（ast）具有較強的抗氧化和抗炎活性，如中國專利cn103504301a一種降壓降糖降尿酸抗腫瘤的蝦青素油的配方及制備方法公開了該配方包括蝦青素食用油液體配方和蝦青素食用油膠囊配方，液體配方中食用油與蝦青素的重量比為100g：80mg，100mg膠囊可治療痛風、高血糖、心腦血管病。二氫槲皮素（dhq）具有較好的抗氧化及代謝調節潛力，如中國專利cn118986959a一種含槲皮素的降尿酸改善痛風的組合物及其應用公開了通過槲皮素以劑量依賴的方式顯著促進鳥乳桿菌cml180的生長，減少了肝臟尿酸的生成并增加了腎臟尿酸的排泄，進而實現對痛風的改善。

3、脂質體作為常用遞送體系，可通過磷脂雙分子層結構改善活性成分的分散性、穩定性及遞送效率。對于理化性質不同的兩種活性成分，共載脂質體可在同一體系中實現共同包埋和同步遞送，具有應用優勢。但普通脂質體在貯藏、熱處理和光照條件下穩定性有限，需進一步優化配方和表面結構。現有技術通常是采用常規脂質體制備工藝，如薄膜分散法或超聲法構建活性成分包埋體系，以磷脂為膜材，并以膽固醇作為膜穩定調節組分；部分研究還會進一步引入多糖包覆，以提高脂質體穩定性。

4、現有天然活性成分在降尿酸方向顯示出一定應用潛力，但存在以下問題：其一，蝦青素（ast）脂溶性強，易受光照、氧氣和溫度影響而降解；二氫槲皮素（dhq）溶解性有限、穩定性不足，口服吸收利用率不高；當二者直接添加于食品或口服體系中，一來活性易損失，二來由于蝦青素是強脂溶性，二氫槲皮素主要是醇溶性，有一定水溶性；兩者在溶解性、親脂/親水性及體內吸收轉運行為等方面存在理化性質的較大差異，導致體內分布和作用時間不同步、不利于同步遞送和協同發揮作用。其二，雖然已存在利用體外xod抑制實驗篩選部分降尿酸活性物質的報道，但針對ast與dhq聯用、并進一步結合聯合指數（ci）分析進行比例優化的研究較少，難以說明某一具體比例是否具有更優協同作用。其三，現有共載脂質體研究更多集中于藥物或化妝品遞送領域，而針對ast與dhq這一組合、并面向食品或營養遞送及降尿酸應用的共載脂質體研究仍相對有限。其四，普通脂質體體系在長期貯藏、加熱或光照條件下易出現粒徑變化、活性物質泄漏和體系不穩定，限制了其實際應用。

技術實現思路

1、本發明要解決的技術問題如下：

2、（1）游離ast和dhq在實際應用中穩定性不足，活性易損失，且不利于同步遞送；

3、（2）針對ast與dhq聯用的降尿酸比例篩選研究相對較少，缺少以xod抑制和ci分析為依據的定量篩選過程；

4、（3）針對ast與dhq組合、并面向食品或營養遞送方向的共載脂質體研究較少；

5、（4）普通脂質體體系環境穩定性有限，在貯藏、熱和光條件下容易發生不穩定現象；

6、（5）現有技術中對膜調節組分和表面包覆組分的選擇，多未圍繞食品和營養遞送場景進行系統優化。

7、針對現有技術的問題，本發明提供了一種蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體及其在制備降尿酸制品中的應用，按照“體外功能篩選—優選比例確定—共載脂質體構建—表面包覆穩態化處理—降尿酸應用驗證”的步驟展開。具體而言，首先采用體外黃嘌呤氧化酶（xod）抑制實驗，對蝦青素（ast）與二氫槲皮素（dhq）的單獨及聯合作用進行評價，篩選出適用于降尿酸方向的優選協同比例；隨后以該優選比例為基礎，采用薄膜分散-超聲法制備ast/dhq共載脂質體，并對處方參數進行優化；在此基礎上，進一步采用羧甲基殼聚糖（cmcs）進行表面包覆，以提高體系穩定性；最后通過理化表征、穩定性試驗和動物實驗對所得體系進行驗證。結果表明，該共載脂質體能夠降低高尿酸模型小鼠的血清尿酸（ua）水平、抑制肝臟xod活性，同時改善腎功能相關指標及組織病理損傷。

8、為達到上述目的，本發明通過以下技術方案實現：一種蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體的制備方法，包括以下步驟：

9、（1）將蝦青素ast、二氫槲皮素dhq、磷脂、甾醇及非離子表面活性劑按比例加入無水乙醇中，充分混合溶解形成均一有機相；其中，ast與dhq質量比為1:6~1:12；磷脂的脂質雙分子層結構，用于實現ast與dhq的共載和穩定遞送；甾醇的骨架結構，可插入脂質雙分子層中，對膜的有序性、流動性及穩定性起調節作用，將其引入脂質體體系有利于形成更穩定的共載結構；非離子表面活性劑用于改善體系分散性和均一性；無水乙醇作為有機相溶劑，具有良好的溶解性和揮發性，可實現ast、dhq等各脂質膜材組分均勻混合，并便于后續旋蒸去除后形成均一脂質薄膜；

10、（2）將所得有機相置于旋轉蒸發裝置中，旋蒸去除全部有機溶劑，使容器內壁形成均勻脂質薄膜；

11、（3）隨后加入緩沖液在室溫條件下進行水化，并通過磁力攪拌形成粗脂質體懸液；水化過程使脂質薄膜在水相中膨脹并剝離，驅動磷脂分子自組裝形成脂質雙分子層結構，從而生成粗脂質體懸液并實現對活性成分的初步包封；

12、（4）將該粗脂質體懸液置于冰浴條件下進行探頭超聲處理，以減小粒徑并提高分散均一性；超聲結束后，將所得脂質體懸液避光保存，得到蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體。

13、進一步的，步驟（1）所述磷脂為大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化大豆磷脂、磷脂酰膽堿中的一種或一種以上磷脂的復配體系；甾醇為膽固醇，β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、谷甾烷醇中的或一種或一種以上的植物甾醇混合物；非離子表面活性劑為吐溫20、吐溫80、司盤60、司盤80或其他聚氧乙烯類非離子表面活性劑，或上述兩種及以上表面活性劑的復配體系。

14、進一步的，步驟（1）中磷脂濃度為3~10?mg/ml，甾醇/磷脂質量比為1:(8~15)，非離子表面活性劑/磷脂質量比為1:(8~12)，dhq/磷脂質量比為1:(3~5)。

15、進一步的，步驟（2）中旋蒸條件為：在30~40℃條件下，以150~200?rpm轉速減壓旋蒸20~30?min，優選為35℃、180?rpm、25?min。上述條件范圍有利于在避免高溫導致活性成分降解的同時,實現有機溶劑的有效去除，從而形成均勻穩定的脂質薄膜。

16、進一步的，步驟（3）水化的時間為30~90?min，磁力攪拌的轉速為?300~700?rpm。在上述條件范圍內，有利于脂質薄膜在水相中充分膨脹并剝離，使磷脂分子充分自組裝形成脂質雙分子層結構，從而生成分散性較好的粗脂質體懸液；同時避免攪拌強度過低導致水化不充分，或過高引起體系不穩定。

17、進一步的，步驟（4）中超聲條件為：超聲功率為?10%~30%，優選為20%；采用間歇超聲方式，超聲時間為3~8?s，間歇時間為2~5?s；總超聲時間為10~20?min，優選為15?min。通過上述間歇超聲條件，可在降低體系熱積累的同時實現脂質體粒徑的有效細化，使所得脂質體具有較小粒徑和較窄粒徑分布；同時可避免連續高強度超聲對脂質雙分子層結構造成破壞，從而有利于提高體系穩定性。

18、進一步的，所述制備方法還包括步驟（5）：以緩沖液配制多糖溶液，將多糖溶液與ast/dhq共載脂質體懸液按體積比1:(0.5~2)?混合，優選為1:1混合，在室溫條件下攪拌，使多糖吸附于脂質體表面形成包覆層；所述多糖為羧甲基殼聚糖cmcs、殼聚糖、海藻酸鈉、果膠、羥丙基甲基纖維素或其衍生物，或兩種及以上多糖的復配體系。

19、進一步的，cmcs溶液的濃度為1~4?mg/ml，優選為2?mg/ml，室溫條件下攪拌40min。在上述條件范圍內，有利于cmcs分子在脂質體表面形成均勻穩定的包覆層，從而提高體系的穩定性；同時避免濃度或攪拌時間過低導致包覆不充分，或過高引起體系黏度增加及分散性下降。

20、羧甲基殼聚糖（cmcs）具有良好的生物相容性、成膜性和表面包覆能力，可在脂質體外層形成親水保護層，從而改善體系在貯藏、熱處理和光照條件下的穩定性。

21、進一步的，步驟（3）和步驟（5）中的緩沖液為0.1?m?ph?7.5的pbs緩沖液，實現脂質薄膜水化、脂質體形成及cmcs包覆的作用。

22、一種上述方法制備的蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體。粒徑為105.94±1.27?nm，pdi為0.23±0.00，ζ電位為-14.58±0.27?mv，ast包封率為94.57±1.99%，dhq包封率為94.88±1.35%，ast負載率約為1.80%，dhq負載率約為15.27%。表明本發明的方法能夠實現對ast和dhq的高效共載，并獲得粒徑較小、分散性較好的脂質體體系。

23、上述蝦青素和二氫槲皮素共載脂質體在制備降尿酸、抑制肝臟黃嘌呤氧化酶xod活性、改善腎功能制品中的應用。本發明將所得共載脂質體用于高尿酸模型小鼠的干預。結果表明，該共載脂質體能夠降低高尿酸模型小鼠的血清尿酸（ua）水平、抑制肝臟xod活性，同時改善腎功能相關指標及組織病理損傷。其中中劑量組，即dhq?50?mg/kg?+?ast?5.56mg/kg，表現較優，整體效果優于游離活性成分組及單藥脂質體混合組。

24、本發明的有益效果為：

25、（1）本發明首先通過體外黃嘌呤氧化酶（xod）抑制實驗，并結合聯合指數（ci）分析，對蝦青素（ast）與二氫槲皮素（dhq）的聯用比例進行篩選，從而確定優選比例為1:9。與經驗性復配相比，該技術方案使活性成分配比具有明確的功能依據，有利于提高兩種成分聯用時的協同作用。

26、（2）本發明將ast與dhq共同負載于同一脂質體體系中，而非采用游離混合或單藥分別遞送的方式。脂質體可改善活性成分的分散性并提供共同載體，有利于提高兩種成分的穩定性和同步遞送能力，從而更好發揮聯合作用。

27、（3）本發明在脂質體體系中引入β-谷甾醇作為膜穩定調節組分。β-谷甾醇可參與脂質雙分子層結構調節，有助于提高脂質體膜結構的穩定性，并為該體系在功能食品和營養遞送方向上的應用提供新的配方選擇。

28、（4）本發明通過對大豆卵磷脂濃度、β-谷甾醇/磷脂質量比、吐溫80/磷脂質量比和dhq/磷脂質量比進行優化，獲得了粒徑較小、分散性較好且包封率較高的共載脂質體體系。由此說明，本發明所采用的處方設計和制備工藝具有較好的可實施性。

29、（5）本發明進一步采用羧甲基殼聚糖（cmcs）對共載脂質體進行表面包覆。cmcs可在脂質體外層形成保護層，有助于提高體系在貯藏、熱處理和光照條件下的穩定性，從而改善普通脂質體環境穩定性不足的問題。

30、（6）本發明所構建的ast/dhq共載脂質體及其cmcs包覆體系，在高尿酸模型中表現出降低血清尿酸、抑制xod活性并改善相關腎損傷指標的作用，說明本發明不僅具有明確的技術實現方案，而且具有實際的降尿酸應用價值。