本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種增強(qiáng)記憶樣nk細(xì)胞的擴(kuò)增和激活方法。
背景技術(shù)：
1、nk細(xì)胞全稱自然殺傷細(xì)胞（natural?killer?cell），是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的核心效應(yīng)細(xì)胞，無需抗原預(yù)先致敏即可殺傷異常細(xì)胞，同時調(diào)控免疫微環(huán)境，在抗腫瘤、抗病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。nk細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，經(jīng)骨髓、胸腺微環(huán)境分化成熟，主要分布于外周血、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)，極少存在于胸腺和黏膜組織。
2、nk細(xì)胞可通過多種殺傷途徑靶向清除異常細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞以及衰老/凋亡異常細(xì)胞等；同時所述nk細(xì)胞還可調(diào)控整體免疫反應(yīng)，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（dc）成熟、輔助t細(xì)胞活化，同時抑制過度炎癥反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)。記憶樣nk細(xì)胞（memory-likenk?cells,?ml-nk）憑借“一次激活、長期應(yīng)答”的獨特優(yōu)勢，在腫瘤免疫治療、抗感染治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊應(yīng)用前景，成為過繼免疫治療的熱門候選細(xì)胞類型。相較普通nk細(xì)胞，其具有體外擴(kuò)增效率更高、活化表型更穩(wěn)定，體內(nèi)存續(xù)時間長、腫瘤浸潤能力強(qiáng)，對免疫抑制微環(huán)境耐受性更好，殺傷活性與抗原特異性顯著提升，臨床治療響應(yīng)率更高且脫靶毒性極低等明顯優(yōu)勢，是更優(yōu)的免疫治療細(xì)胞類型。但從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的過程中，其應(yīng)用仍面臨多重瓶頸。記憶樣nk細(xì)胞的誘導(dǎo)依賴特定細(xì)胞因子組合，但不同研究團(tuán)隊的誘導(dǎo)時間、細(xì)胞因子濃度、培養(yǎng)體系存在顯著差異，導(dǎo)致制備的細(xì)胞在記憶表型純度、殺傷活性、細(xì)胞因子分泌能力上存在較大異質(zhì)性，無法形成統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，直接影響療效的可重復(fù)性。另外，臨床治療需單次輸注大量（通常≥1×109）記憶樣nk細(xì)胞，但現(xiàn)有誘導(dǎo)方案獲得的細(xì)胞數(shù)量往往難以滿足臨床劑量需求，且盲目擴(kuò)增易導(dǎo)致細(xì)胞功能耗竭，長期培養(yǎng)會使細(xì)胞殺傷活性下降、ifn-γ分泌能力減弱，尤其自體來源的記憶樣nk細(xì)胞，可能因患者自身免疫狀態(tài)不佳，進(jìn)一步降低擴(kuò)增效率與功能穩(wěn)定性。因此對記憶樣nk細(xì)胞的擴(kuò)增和激活等技術(shù)進(jìn)行改良，是提高nk細(xì)胞利用率的重要手段。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)記憶樣nk細(xì)胞的擴(kuò)增和激活方法，通過代謝物和表觀酶抑制劑的雙軸協(xié)同，實現(xiàn)記憶樣nk細(xì)胞的擴(kuò)增和功能的雙提升。
2、本發(fā)明提供了一種強(qiáng)記憶樣nk細(xì)胞的擴(kuò)增方法，包括將nk細(xì)胞置于擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得強(qiáng)記憶樣nk細(xì)胞；
3、所述擴(kuò)增培養(yǎng)基包括完全培養(yǎng)基、il-2，il-12、il-15、il-18和α-酮戊二酸鈉；
4、所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中α-酮戊二酸鈉的濃度為0.1~2?mm。
5、本發(fā)明一種實施方式中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中il-2的濃度為1000?u/ml，所述il-12濃度為1~100ng/ml，所述il-15濃度為1~100ng/ml，所述il-18濃度為1~100ng/ml。
6、本發(fā)明一種實施方式中，所述完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括以下任一種：vivo15培養(yǎng)基、gibco?cts?aim?v、hipp-t009、immunocult?-xf、immunocult??nk?cellexpansion?medium和nk?macs??medium；
7、所述完全培養(yǎng)基中還包括體積百分含量為5%的自體血漿。
8、本發(fā)明一種實施方式中，所述nk細(xì)胞的獲得方法，包括以下步驟：將pbmc細(xì)胞接種到完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收獲nk細(xì)胞。
9、本發(fā)明一種實施方式中，所述培養(yǎng)的參數(shù)，包括37℃、5%?co2靜置培養(yǎng)24?h。
10、本發(fā)明還提供了一種nk細(xì)胞的再激活方法，包括在所述擴(kuò)增方法的培養(yǎng)體系中加入dot1l抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)后得再激活的nk細(xì)胞。
11、本發(fā)明一種實施方式中，所述體系中dot1l抑制劑的濃度為10~100?nm。
12、本發(fā)明一種實施方式中，所述dot1l抑制劑包括以下至少一種：epz-5676、epz004777、sgc707和syc-522。
13、本發(fā)明還提供了利用上述再激活方法獲得的再激活的nk細(xì)胞。
14、本發(fā)明還提供了上述再激活的nk細(xì)胞在制備靶向清除異常細(xì)胞的試劑中的應(yīng)用。
15、有益效果：本發(fā)明提供了一種體外促進(jìn)nk細(xì)胞的擴(kuò)增方法，在nk細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中加入低濃度的α-酮戊二酸鈉（α-kg-na），作為三羧酸循環(huán)中間體，α-kg-na可提升nk細(xì)胞線粒體呼吸鏈效率，促進(jìn)atp生成，為快速增殖提供能量。本發(fā)明還提供了一種提高體外擴(kuò)增nk細(xì)胞殺傷活力的方法，包括在培養(yǎng)基中加入低濃度的dot1l抑制劑，所述dot1l抑制劑可通過抑制h3k79me2/3，解除對ifng、prf1等細(xì)胞毒性基因的轉(zhuǎn)錄抑制，同步增強(qiáng)殺傷功能。本發(fā)明通過分別在常規(guī)nk細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入低劑量的α-kg-na和特異性dot1l抑制劑，通過“代謝-表觀”雙軸協(xié)同，實現(xiàn)nk細(xì)胞擴(kuò)增，且不依賴飼養(yǎng)細(xì)胞或基因改造。經(jīng)實施例驗證，α-kg-na提高的乙酰-coa水平為組蛋白乙酰化提供底物，與dot1l抑制共同重塑染色質(zhì)，實現(xiàn)“增殖-功能”的雙提升，為nk細(xì)胞的臨床利用提供來源。
1.一種強(qiáng)記憶樣nk細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括將nk細(xì)胞置于擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得強(qiáng)記憶樣nk細(xì)胞；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基包括完全培養(yǎng)基、il-2、il-12、il-15、il-18和α-酮戊二酸鈉；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中α-酮戊二酸鈉的濃度為0.1~2?mm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述擴(kuò)增方法，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中il-2的濃度為1000u/ml，所述il-12濃度為1~100ng/ml，所述il-15濃度為1~100ng/ml，所述il-18濃度為1~100ng/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述擴(kuò)增方法，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括以下任一種：x-vivo15培養(yǎng)基、gibco?cts?aim?v、hipp-t009、immunocult?-xf、immunocult?nk?cell?expansion?medium和nk?macs??medium；所述完全培養(yǎng)基中還包括體積百分含量為5%的自體血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述擴(kuò)增方法，其特征在于，所述nk細(xì)胞的獲得方法，包括以下步驟：將pbmc細(xì)胞接種到完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收獲nk細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述擴(kuò)增方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的參數(shù)，包括37℃、5%?co2靜置培養(yǎng)24?h。
6.一種nk細(xì)胞的再激活方法，其特征在于，包括在權(quán)利要求1~5任一項所述擴(kuò)增方法的培養(yǎng)體系中加入dot1l抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)后得再激活的nk細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述再激活方法，其特征在于，所述體系中dot1l抑制劑的濃度為10~100?nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述再激活方法，其特征在于，所述dot1l抑制劑包括以下至少一種：epz-5676、epz004777、sgc707和syc-522。
9.利用權(quán)利要求6~8任一項所述再激活方法獲得的再激活的nk細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9所述再激活的nk細(xì)胞在制備靶向清除異常細(xì)胞的試劑中的應(yīng)用。