本發明涉及免疫細胞體外培養，具體為一種靶向病毒抗原的tcr細胞體外擴增培養方法。
背景技術：
1、靶向病毒抗原的tcr細胞療法，是針對慢性病毒感染、病毒相關惡性腫瘤的重要干預方式，核心是通過體外擴增，獲得足量能特異性識別并清除病毒感染細胞的功能性tcr細胞。目前行業內通用的培養流程，多是先通過基因檢測篩選出目標tcr克隆，再用固定的抗原刺激條件、細胞因子配比完成全程擴增，基因檢測僅用于培養前的克隆篩選和培養結束后的終末質檢，培養過程中僅做常規的細胞計數、活率檢測，無針對性的過程干預。
2、現有的靜態固定參數培養模式，無法適配t細胞擴增過程中的狀態變化，非靶向t細胞克隆增殖速度更快，很容易擠占靶向克隆的培養資源和增殖空間，培養結束后靶向tcr克隆的占比普遍偏低，多數只能達到30%-60%。只能通過終末磁珠分選來提高純度，不僅會造成大量細胞損失，還會明顯降低細胞活率，同時批次間的細胞質量差異極大，很難穩定產出高純度、高活性的靶向tcr細胞，無法穩定滿足臨床使用的需求。
技術實現思路
1、本發明的目的就是為了彌補現有技術的不足，提供了一種靶向病毒抗原的tcr細胞體外擴增培養方法，該方法通過構建靶向病毒抗原tcr細胞體外擴增的閉環培養流程，先分離外周血單個核細胞完成靶向t細胞初始激活，建立基礎擴增培養體系啟動培養；再在擴增預設關鍵節點無菌微量取樣，經單細胞tcr測序識別克隆序列并計算靶向、非靶向克隆豐度，依據豐度分級閾值動態調整培養參數，非靶向克隆超標時即時執行靶向陽性富集，循環操作至預設擴增周期結束后收獲細胞。該方法打破傳統靜態培養的局限，將豐度檢測融入培養全程，精準鎖定靶向克隆增殖優勢，減少分選帶來的細胞活率損失，還可通過雙檢測校正提升調控精度，縮小批次間質量差異，能穩定產出符合臨床質控標準的高純度靶向tcr細胞。
2、本發明為解決上述技術問題，提供如下技術方案：一種靶向病毒抗原的tcr細胞體外擴增培養方法，該方法的具體步驟為：
3、s1，樣本處理與初始激活：分離獲取外周血單個核細胞，采用目標病毒抗原表位肽完成靶向t細胞的初始激活，建立基礎擴增培養體系，將激活后的t細胞置于培養體系中啟動擴增培養；
4、s2，關鍵節點微量取樣：在擴增培養的預設關鍵節點，對培養體系進行無菌微量取樣，取樣后補足等體積預熱的新鮮基礎培養基；
5、s3，測序檢測與豐度計算：對取樣細胞完成單細胞tcr測序，識別tcr克隆的cdr3區序列，比對目標病毒抗原表位匹配的tcr參考序列庫，篩選靶向病毒抗原的tcr克隆，計算靶向tcr克隆的實時豐度，所述非靶向病毒抗原的tcr克隆豐度=100%-靶向tcr克隆實時豐度；
6、s4，培養參數動態調控：將測得的靶向tcr克隆實時豐度與預設分級閾值對比，根據對比結果動態調整培養體系中的病毒抗原表位肽刺激濃度、細胞因子配比；
7、s5，靶向陽性克隆富集：當非靶向病毒抗原的tcr克隆豐度超過預設閾值時，對培養體系中的細胞執行靶向陽性富集操作，富集完成后將細胞放回培養體系繼續擴增；
8、s6，閉環循環培養收獲：重復步驟s1至步驟s6，形成連續閉環培養循環，直至完成預設擴增周期后收獲細胞。
9、進一步地，所述s1步驟中，初始激活采用負載目標病毒抗原表位肽的自體樹突狀細胞作為抗原呈遞細胞，樹突狀細胞與外周血單個核細胞的數量比為1:5-1:20，激活培養時長為24-72h；所述目標病毒抗原表位肽的終濃度為1-10μg/ml。
10、更進一步地，所述s1步驟中，基礎擴增培養體系采用無血清化學成分限定培養基為基礎，添加終濃度1%-3%的重組人血清白蛋白、200-500iu/ml的il-2、5-20ng/ml的il-7、5-20ng/ml的il-15，體系ph值控制在7.2-7.4，滲透壓控制在280-320mosm/kg。
11、更進一步地，所述s2步驟中，預設關鍵節點為擴增培養的第0天、第3天、第7天、第10天四個固定節點；每個節點取樣體積≤100μl，取樣體積占培養總體系的比例≤0.5%，新鮮基礎培養基預熱至36.5℃-37.5℃。
12、更進一步地，所述完成第0天節點的單細胞tcr測序、獲得靶向tcr克隆的特異性cdr3區序列后，第3天、第7天、第10天節點取樣的同時，同步取細胞懸液樣本，采用微滴式數字pcr對靶向tcr克隆進行絕對定量檢測，將定量結果與同節點單細胞tcr測序的豐度結果進行線性擬合校正，以校正后的豐度結果作為步驟s4參數調整的最終依據。
13、更進一步地，所述s3步驟中的單細胞tcr測序，從樣本制備到豐度結果輸出的全流程周期≤24h；所述靶向tcr克隆實時豐度按照以下公式計算：靶向tcr克隆實時豐度＝靶向?tcr克?隆?的?有?效?細?胞?數測?序?總?有?效?細?胞?數×100%。
14、更進一步地，所述s4步驟中的參數調整操作，在同節點取樣后的48h內完成；步驟s4與步驟s5中所述的預設閾值，統一設置為三級分級閾值，對應的調整策略具體為：
15、當靶向tcr克隆實時豐度≥80%時，維持培養體系當前的病毒抗原表位肽刺激濃度與細胞因子配比不變；
16、當靶向tcr克隆實時豐度為50%-80%時，將病毒抗原表位肽刺激濃度提升至本次取樣前體系當前濃度的110%-130%，同時將il-2濃度提升至本次取樣前體系當前濃度的1.2-1.8倍，il-7、il-15濃度保持不變；
17、當靶向tcr克隆實時豐度＜50%時，維持當前培養體系參數不變，先執行s5步驟的靶向陽性富集操作，富集完成后，再將病毒抗原表位肽刺激濃度調整至本次取樣前體系當前濃度的130%-150%，同時將il-2終濃度調整為400-600iu/ml、il-7終濃度調整為15-25ng/ml、il-15終濃度調整為15-25ng/ml。
18、更進一步地，所述s5步驟中，靶向陽性富集操作采用生物素標記的病毒抗原表位肽-mhc四聚體結合鏈霉親和素免疫磁珠的陽性分選方式完成，分選后靶向tcr陽性細胞的占比≥90%，細胞活率≥90%。
19、更進一步地，所述s6步驟中的預設擴增周期為12-16天，收獲細胞的合格標準為：細胞總擴增倍數≥1000倍，靶向tcr克隆豐度≥90%，細胞活率≥95%，無菌、內毒素、支原體檢測均為陰性。
20、與現有技術相比，該一種靶向病毒抗原的tcr細胞體外擴增培養方法具備如下有益效果：
21、一、本發明通過擴增全程四個固定節點的微量取樣、單細胞tcr測序實時追蹤，把靶向克隆豐度檢測直接嵌入培養過程，而非僅做培養前后的篩選或質檢，全程能實時讀取靶向病毒抗原的tcr克隆占比變化，一旦非靶向克隆出現過度增殖，能夠及時調整抗原刺激強度和細胞因子配比，提前鎖定靶向克隆的增殖優勢，既能穩定拉高靶向克隆的終末占比，也能減少分選帶來的細胞活率損失。
22、二、本發明通過三級分級閾值的精準調整規則，結合單細胞測序與數字pcr的豐度結果雙向校正，給每一步培養參數調整提供明確的量化依據，不用全程套用一套固定培養參數，能根據細胞實際擴增狀態匹配對應的培養條件，減少無效培養操作，同時能避免單一測序方式帶來的豐度計算偏差，讓每一批次的培養過程都可控，能有效縮小批次間的細胞質量差異，穩定產出符合臨床使用要求的細胞。
23、本發明的其他優點、目標和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領域技術人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發明的實踐中得到教導。