本發明涉及一種醫用整形填充的高分子凝膠制備方法，具體涉及一種絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠顆粒的制備方法。
背景技術：
1、透明質酸鈉凝膠已被廣泛用于面部及身體其他部位皮膚的醫美整形填充，具有鎖定水分能力強、生物相容性好、可完全被生物降解等優點，可有效減輕皮膚皺紋、改善皮膚外觀和結構，緩解皮內和皮下組織衰老。但是，透明質酸鈉凝膠在體內的生物降解速度快，且不能引導缺失的皮內或皮下軟組織再生。
2、蠶絲絲素蛋白具有良好的生物相容性，能引導組織再生，生物降解速度較慢。蠶絲手術縫合線已在臨床廣泛應用數十年。用蠶絲絲素蛋白制備的凝膠、多孔海綿、三維支架均顯示出對組織修復細胞的黏附能力強和在降解前可引導組織再生的優異性能。用絲素蛋白與透明質酸鈉共混制備絲素蛋白/透明質酸鈉復合凝膠用于皮內和皮下軟組織填充，可以利用絲素蛋白的性能優點彌補透明質酸鈉凝膠性能的不足。
3、對透明質酸鈉進行交聯是制備用于軟組織填充的透明質酸鈉凝膠的技術關鍵。用于透明質酸鈉交聯的常見交聯劑有1,4-丁二醇二縮水甘油醚、二乙烯基砜、碳化二亞胺等。目前市場上的大多數透明質酸鈉凝膠產品是用1,4-丁二醇二縮水甘油醚（bdde）作為交聯劑，它具有交聯效率高、交聯產物毒性低的優點。但是，通常bdde交聯透明質酸鈉的反應需在堿性或酸性條件下才能進行，而在堿性條件下絲素蛋白易被水解成肽段或游離氨基酸，弱酸性條件下則因絲素蛋白大分子表面凈電荷少而易聚集、沉淀，強酸性條件下絲素蛋白則易被水解成肽段或游離氨基酸。因此，研發新的交聯技術，對制備絲素蛋白/透明質酸鈉復合凝膠至關重要。
4、在本發明之前，專利cn?102836465?a將透明質酸鹽用質量濃度1%的氫氧化鈉水溶液配制成0.1?g/ml的透明質酸鹽溶液，然后將絲素蛋白微粒加入到透明質酸鹽溶液中，再加入二乙烯基砜、乙二醇二縮水甘油醚、丁二醇二縮水甘油醚或聚丙二醇二縮水甘油醚中的一種或兩種以上交聯劑混勻，25～60℃條件下靜置2～8?h，制成絲素蛋白/透明質酸復合凝膠。該方法使用的強堿性反應環境將造成絲素蛋白大幅度水解，凝膠內部的絲素蛋白難以達到預期功效。
5、專利cn?110527116?a先用酪胺對透明質酸進行接枝改性，然后用漆酶使絲素蛋白和酪胺接枝改性后的透明質酸發生交聯，制得絲素/透明質酸復合水凝膠。專利cn114601958?a先用多巴胺改性醛基化透明質酸，然后與絲素蛋白、明膠混合進行交聯反應，同時利用三價鐵離子的配位，制備透明質酸/絲素蛋白雙交聯可注射水凝膠。這些方法都需先用各種化學試劑對絲素蛋白或透明質酸進行化學改性，凝膠制備過程中使用的化學試劑及化學反應步驟繁多，多種化學試劑的使用及化學反應副產物的產生、殘留，勢必會增大制得凝膠的細胞毒性風險。另一方面，由于絲素蛋白在水溶液中具有自發聚集、團聚的趨勢，大分子鏈難以充分伸展，直接將絲素蛋白水溶液與透明質酸水溶液混合，易使絲素蛋白以團聚物的形式鑲嵌于透明質酸大分子網絡的間隙內，難以有效形成兩種大分子組分之間的互穿網絡或雙網絡結構。這樣的凝膠植入體內時，當透明質酸網絡被降解后，凝膠整體易崩塌，抵抗生物降解的能力不足。
技術實現思路
1、針對現有絲素蛋白/透明質酸鈉（或透明質酸）復合凝膠制備技術的不足，本發明的目的是提供一種絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠顆粒的制備方法。
2、本發明解決上述問題所采取的技術方案為：一種絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠顆粒的制備方法，將蠶絲脫膠、溶解、透析后，得到絲素蛋白水溶液。其特征在于，再進行以下步驟的加工：
3、p1．將絲素蛋白水溶液加熱處理一定時間，隨后快速冷凍，得到絲素蛋白冷凍體；
4、p2.將絲素蛋白冷凍體解凍后，得到變性絲素蛋白水溶液；
5、p3.解凍后的變性絲素蛋白水溶液立即與透明質酸鈉溶液混合，并在溶液中加入二環氧甘油醚類交聯劑，得到絲素蛋白/透明質酸鈉/交聯劑混合溶液；
6、p4.將絲素蛋白/透明質酸鈉/交聯劑混合溶液快速冷凍，得到混合溶液冷凍體；
7、p5.將絲素蛋白/透明質酸鈉/交聯劑混合溶液冷凍體置于融化溫度環境中存放一定時間，接著再進行快速冷凍，如此反復進行融-凍處理數次后，得到絲素蛋白/透明質酸鈉復合物冷凍體；
8、p6.將絲素蛋白/透明質酸鈉復合物冷凍體冷凍干燥，得到絲素蛋白/透明質酸鈉復合物固體；
9、p7.將絲素蛋白/透明質酸鈉復合物固體冷凍造粒，篩分，得到絲素蛋白/透明質酸鈉復合物固體顆粒；
10、p8.將絲素蛋白/透明質酸鈉復合物固體顆粒浸漬于熱水中處理一定時間，得到絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠顆粒粗制品；
11、p9.絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠粗制品先用常溫水洗滌，再用磷酸鹽緩沖生理鹽水平衡，濾除多余液體后，得到絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠顆粒。
12、優選的，所述步驟p1中，加熱處理絲素蛋白水溶液的溫度為95～100℃，處理時間為10～120分鐘；快速冷凍溫度為-196～-20℃，冷凍時間為2～6小時。
13、優選的，所述步驟p2中，解凍溫度為2～25℃。
14、優選的，所述步驟p3中，所用透明質酸鈉的平均分子量為500～3000?kda；混合溶液中絲素蛋白/透明質酸鈉的質量比為90/10～10/90，混合溶液中絲素蛋白和透明質酸鈉二者的合計質量分數為0.5～2.5%；所述二環氧甘油醚類交聯劑是1,4-丁二醇二縮水甘油醚、乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、新戊二醇二縮水甘油醚中的一種或兩種的組合；加入的二環氧甘油醚類交聯劑與混合溶液中絲素蛋白和透明質酸鈉二者的合計質量之比為0.1/1.0～0.4/1.0。
15、優選的，所述所述步驟p4中，將絲素蛋白/透明質酸鈉/交聯劑混合溶液快速冷凍的溫度為-196～-20℃，冷凍時間為2～6小時。
16、優選的，所述所述步驟p5中，融化溫度為2～8℃，融化溫度存放時間為0.5～2.0小時，反復融-凍次數為2～5次。
17、優選的，所述步驟p7中，絲素蛋白/透明質酸鈉復合物固體顆粒的粒徑為50～500μm。
18、優選的，所述所述步驟p8中，處理絲素蛋白/透明質酸鈉復合物固體顆粒的熱水溫度為40～60℃，處理時間為12～24小時，每3小時左右更換一次熱水。
19、本發明的原理是：
20、（1）對絲素蛋白溶液采用加熱處理-快速冷凍的加工工藝，拆解絲素蛋白大分子之間的相互作用，更重要的是拆解絲素蛋白大分子內部的氫鍵、疏水鍵、離子鍵等次價鍵相互作用，使絲素蛋白大分子鏈充分伸展。隨后進行快速冷凍、固定，使絲素蛋白難以快速回復到原來的團聚狀態。這種變性后的絲素蛋白解凍后立即與透明質酸鈉共混時，與透明質酸鈉之間相互作用位點增多，能夠實現二者之間的均質復合，并形成兩種大分子的互穿網絡結構。
21、（2）通過對絲素蛋白/透明質酸鈉/交聯劑混合溶液進行快速冷凍以及隨后的反復融-凍處理，依靠冰晶的作用和化學勢的驅動，一方面使體系內的溶質分子之間距離縮短，另一方面誘導絲素蛋白和透明質酸鈉側鏈上的化學活性基團暴露，誘發二環氧甘油醚類交聯劑與絲素蛋白、透明質酸鈉大分子的交聯反應，其后的冷凍干燥過程對交聯反應具有進一步增強作用。因此，不需堿性或酸性條件，在中性條件下能夠實現二環氧甘油醚類交聯劑對絲素蛋白和透明質酸鈉的交聯反應，從而制得絲素蛋白/透明質酸鈉交聯凝膠。
22、與現有技術相比，本發明的優點在于：
23、（1）由于對絲素蛋白溶液采用加熱處理-快速冷凍的加工工藝，使絲素蛋白大分子鏈充分伸展，與透明質酸鈉共混時二者之間相互作用位點增多而形成互穿網絡結構，避免絲素蛋白以聚集體的形式鑲嵌于透明質酸鈉大分子網絡的間隙內，制得的絲素蛋白/透明質酸鈉凝膠中透明質酸組分被降解后凝膠整體不易崩塌，抵抗生物降解的能力增強。
24、（2）由于對絲素蛋白/透明質酸鈉/交聯劑混合溶液進行了快速冷凍、反復融-凍處理、冷凍干燥的加工工藝，在中性條件下能實現二環氧甘油醚類交聯劑對絲素蛋白和透明質酸鈉的交聯反應，避免堿性或酸性條件對絲素蛋白的水解破壞，使絲素蛋白/透明質酸鈉凝膠中的絲素蛋白組分持續地發揮抵抗生物降解和引導軟組織再生的功能。
25、（3）不采用化學手段，而是采用物理手段誘發、增強二環氧甘油醚類交聯劑對絲素蛋白和透明質酸鈉大分子的交聯反應，不需添加其他化學試劑，能夠有效降低凝膠的細胞毒性。
26、（4）二環氧甘油醚類交聯劑不僅能將絲素蛋白與透明質酸鈉大分子之間交聯，也能將絲素蛋白大分子之間以及透明質酸鈉大分子之間交聯，且交聯效率高，有利于進一步延緩絲素蛋白/透明質酸鈉凝膠的生物降解。