一對雙鉤巢粉虱特異性ss-coi引物及快速pcr檢測方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：一對雙鉤巢粉虱特異性ss-coi引物及快速pcr檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明ー對雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物及快速PCR檢測方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
雙鉤巢粉風(fēng)Paraleyrodes pseudonaranjae Martin,屬同翅目、粉風(fēng)科、巢粉風(fēng)屬，是ー種世界性檢疫害蟲。雙鉤巢粉虱的植物寄主較多，有30科49屬63種，分別為蕓香科9種,?？?種,豆科和菌草科各5種,大戟科4種，番蒸枝科3種,棕櫚科、樟科、桃金娘科、藤黃科、杜鵑花科、野牡丹科及無患子科各2種，旅人蕉科、蝶形花科、漆樹科、菊科、三白草科、錦葵科、使君子科、木棉科、木蘭科、杜英科、榆科、買麻藤科、山茶科、冬青科、金縷梅科、五爺科、菝葜科等各I種。其中，樟科Lauraceae、旅人蕉科Strelitziaceae、使君子科 Combretaceae、木棉科 Bombacaceae、菊科 Compositae、木蘭科 Magnoliaceae 和杜英科Elaeocarpaceae等7科為雙鉤巢粉風(fēng)寄主植物的首次報道,新記錄寄主植物15種。而且，隨著雙鉤巢粉虱入侵區(qū)域的逐漸擴(kuò)大和定居時間的推移，其寄主植物的種類和危害程度有進(jìn)ー步増加的趨勢。雙鉤巢粉虱以成蟲和若蟲進(jìn)行為害，其危害方式主要包括兩個方面。其ー是直接危害，即，以成蟲和若蟲在葉片背面及正面刺吸寄主植物汁液，由于其繁殖能力強(qiáng)，發(fā)育速度快，蟲ロ密度大，使寄主植物的生長發(fā)育嚴(yán)重受阻，葉片變黃、畸形乃至提前落葉，長勢明顯衰弱；其ニ是間接危害，即，成蟲和若蟲在寄主植物葉片背面分泌大量的蠟粉、蠟絲和蜜露，使葉片背面呈現(xiàn)一片雪白，并同時誘發(fā)嚴(yán)重的煤煙病，使葉片表面覆蓋ー層黑色霉層，嚴(yán)重影響寄主植物葉片的光合作用、呼吸作用以及蒸騰作用，降低了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，成蟲和若蟲分泌大量白色蠟粉、蠟絲，嚴(yán)重影響了花卉及綠化樹木的觀賞價值。如雙鉤巢粉在入侵我國香港僅3年后，就對柑橘類果樹以及觀賞植物杜鵑產(chǎn)生嚴(yán)重危害；而在海南，入侵不足I年便對番荔枝、番石榴、柑橘、油梨、椰子、檳榔、欖仁樹等的生長發(fā)育產(chǎn)生了極大的不利影響，對我國觀賞植物及果樹苗木的出口貿(mào)易構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。 雙鉤巢粉虱原產(chǎn)于南美洲，已在佛羅里達(dá)、夏威夷、百慕大和香港定居。1996年在香港發(fā)現(xiàn)時，僅危害幾種植物，且發(fā)生量很低，但3年后就使柑橘類和杜鵑的生產(chǎn)遭受重倉1J。我國于2006年9月在海南省三亞市和文昌市首次發(fā)現(xiàn)雙鉤巢粉虱為害椰子，2007年8月在廣西省南寧市發(fā)現(xiàn)其危害柑橘，2008年在廣東省廣州市的砂糖橘和柚子上發(fā)現(xiàn)其成蟲和若蟲的危害；截止2009年，雙鉤巢粉虱已在海南省的18個縣市有不同程度的發(fā)生，并對20科29屬37種植物產(chǎn)生不同程度的危害；其中，番荔枝、番石榴、椰子、檳榔、油梨、柑桔等受害最為嚴(yán)重。雙鉤巢粉虱是傳入我國的另ー種外來入侵害蟲，鑒于其目前僅在我國香港、廣東、廣西、海南發(fā)現(xiàn)，而且一旦發(fā)生即可造成嚴(yán)重危害，并在我國具有進(jìn)ー步擴(kuò)散和蔓延的趨勢。而人為傳播是雙鉤巢粉虱擴(kuò)散蔓延的主要方式，因此加強(qiáng)對雙鉤巢粉虱的檢疫和監(jiān)測檢測是杜絕其進(jìn)一歩傳播擴(kuò)散的根本途徑。雙鉤巢粉虱體型微小，雌性成蟲體長0. 96-1. Ilmm,雄性個體稍小；卵長0. 26-0. 31mm，淡黃色，半透明；初孵若蟲體長0. 37-0. 42mm，鮮黃色，具淡黃白色區(qū)域；卵及初孵若蟲肉眼均難以發(fā)現(xiàn)。而加強(qiáng)檢疫和監(jiān)測檢測必需建立ー套快速準(zhǔn)確的分子檢測方法。目前國際上用于雙鉤巢粉虱鑒定的方法主要有I)形態(tài)特征鑒定；2) COI測序等。但目前國內(nèi)針對雙鉤巢粉虱尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。COI技術(shù)曾用于鑒別雙鉤巢粉虱及其近緣種。mtDNA COI技術(shù)檢測是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，對目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物回收、純化、測序，根據(jù)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建來 判斷檢測結(jié)果。SS-COI PCR技術(shù)檢測是在mtDNA COI技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測結(jié)果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供一對雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物。本發(fā)明的另ー目的是提供雙鉤巢粉虱SS-COI特異性片段。本發(fā)明的另ー目的為提供一種雙鉤巢粉虱的特異性快速PCR檢測方法。本發(fā)明的再一目的為提供一種雙鉤巢粉虱的特異性快速檢測試劑盒。本發(fā)明根據(jù)雙鉤巢粉虱的線粒體DNA序列，設(shè)計ー對種特異性引物，該引物只對雙鉤巢粉虱具有擴(kuò)增能力。是對雙鉤巢粉虱mtDNA COI技術(shù)檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同吋，本方法采用SS-COI PCR技術(shù)，提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測時間，在雙鉤巢粉虱檢測/監(jiān)測方面具有很高的應(yīng)用價值，可以試劑盒的形式在我國ロ岸、有機(jī)果蔬生產(chǎn)基地、鮮切花生產(chǎn)基地，以及蔬菜、觀賞植物和果樹種苗/植株等的調(diào)運中推廣。根據(jù)本發(fā)明的一對雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物為引物PPZYF :5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3' (SEQ ID No. I);和引物PPZYR :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3' (SEQ ID No. 2)。根據(jù)本發(fā)明的雙鉤巢粉虱SS-COI特異性片段，其序列如SEQ ID No. 3所示。因此，根據(jù)本發(fā)明的雙鉤巢粉虱種特異性檢測方法包括使用上述SS-COI引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟，或者，所述方法包括使用探針與上述特異性片段進(jìn)行雜交的步驟。根據(jù)本發(fā)明的雙鉤巢粉虱種特異性檢測試劑盒包括上述雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物?；蛘撸鶕?jù)本發(fā)明的雙鉤巢粉虱種特異性檢測試劑盒包括上述雙鉤巢粉虱SS-COI特異性片段(SEQ ID No. 3所示)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用分子雜交技術(shù)進(jìn)行雙鉤巢粉虱種特異性檢測時，可以根據(jù)本領(lǐng)域的公知常識設(shè)計與本申請的雙鉤巢粉虱特異性片段(SEQ ID No. 3所示)特異性雜交的探針。本發(fā)明的雙鉤巢粉虱種特異性SS-COI引物及快速PCR檢測方法，用于快速檢測雙鉤巢粉虱。與國際現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢I)檢測準(zhǔn)確性高。本方法根據(jù)雙鉤巢粉虱種特異性SS-COI標(biāo)記設(shè)計的引物PPZYF和PPZYR，在PCR快速檢測雙鉤巢粉虱時，可擴(kuò)增出233bp的片段，不僅對雙鉤巢粉虱的單頭成蟲和ニ齡、三齡、四齡若蟲可以進(jìn)行檢測，對于單粒卵和單頭初孵若蟲也能準(zhǔn)確檢測。2)操作簡便快捷。本發(fā)明采用PCR技術(shù)，操作過程簡單、快速、高效。一般整個過程可在5個小時內(nèi)完成。
3)特異性強(qiáng)。本發(fā)明設(shè)計的引物可特異性檢測雙鉤巢粉虱，在其近緣種、屬粉虱中無擴(kuò)增產(chǎn)物。因此本方法實用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及害蟲監(jiān)測/檢測的需要。


圖I為引物PPZYF/PPZYR對雙鉤巢粉虱及其近緣種、屬粉虱的SS-COI PCR擴(kuò)增結(jié)果，M:分子量標(biāo)準(zhǔn) Trans2K ; I:雙鉤巢粉風(fēng) Paraleyrodes pseudonaranjae Martin ；2: ZHJ-I型煙粉虱；3:ZHJ-2型煙粉虱；4:B型煙粉虱；5:Q型煙粉虱；6:溫室粉虱;7 黑刺粉虱；8:柑橘粉虱；9:螺旋粉虱；10:陰性對照(超純水)。·
圖2為引物PPZYF/PPZYR對雙鉤巢粉虱不同蟲態(tài)和性別的SS-COI PCR擴(kuò)增結(jié)果，M:分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K ;1:單粒卵；2: —齡若蟲；3: ニ齡若蟲；4:三齡若蟲；5:四齡若蟲；6:雄性成蟲；7:雌性成蟲；8:陰性對照(超純水)。圖3為引物PPZYF/PPZYR對雙鉤巢粉虱檢測閾值的測定，M:分子量標(biāo)準(zhǔn) Trans2K ;1-9 分別為 1:1/320; 2:1/640; 3:1/1280; 4:1/2560; 5:1/5120; 6:1/10240; 7:1/20480; 8:1/40960; 9:1/81920 頭雌性成蟲;10:陰性對照(超純水)。
具體實施例方式實施例I :引物PPZYF/PPZYR對雙鉤巢粉虱的擴(kuò)增效果I)粉虱模板DNA的制備將單頭粉虱置于滴有20iiL提取緩沖液(50mM Tris-HCl, I mM EDTA、1%SDS、20mMNaCl, pH 8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液以微量移液器移入I. 5mL離心管；然后以200 u L緩沖液分2次清洗勻漿器，移入同一離心管，混勻，加入5iiL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于60° C水浴Ih(中途混勻I次)；然后沸水浴8min,加入220 u L氯仿/異戊醇(V: V=24:1)抽提液,輕柔混勻數(shù)十次后,冰上放置30min ;4° C、12000r/min離心20min,取上清液,加入440 u L預(yù)冷的無水こ醇,輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20° C放置30min ;4° C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液。加入500 ii L預(yù)冷的75%こ醇洗漆,4° C、12000r/min離心15min,小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后每管加入20 y L超純水，充分溶解后于-40° C保存?zhèn)溆谩?)檢驗雙鉤巢粉虱的特異性引物的合成Primer PPZYF 5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3'PrimerPPZYRj' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3'由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為20ii L，其中 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii L、dNTP (IOmM) 0. 4 ii L、Taq聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 15 ii L、上游引物和下游引物(IOuM)各0. 5 y L、模板DNA1. 0 y L、超純水 15. 45 u L04) PCR擴(kuò)增程序
94。C 預(yù)變性 5min ;30 個循環(huán)94。C 30sec、61° C 30sec、72。C 40sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR產(chǎn)物的鑒定取3 ii L PCR產(chǎn)物用I. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化こ錠染色后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。結(jié)果利用引物primer PPZYF/PPZYR以雙鉤巢粉虱線粒體DNA為模板，以不同生物型的煙粉虱(包括=ZHJ-I型、ZHJ-2型、B型、Q型)以及溫室粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、螺旋粉虱等4種其他常見種類的粉虱為對照進(jìn)行SS-COI PCR擴(kuò)增。在I泳道的雙鉤巢粉虱中擴(kuò)增出了 233bp的目的條帶(見圖I的I泳道)，在其他8種近緣種、屬的粉虱中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明我們所篩選的來自雙鉤巢粉虱線粒體DNA的特異性SS-COI PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。 SEQ ID No. 3 taaaggaact aatcaatttc caaatccccc gataactaaa ggcatagtta taaaaaaaat 60tattaaaaaa gcatgagaag taactaaaac attatataat tgatcactta ttataaaaga 120tccaatattc ctcaattcca ttcgaattat caaacttaat gaggttccta ataaccctct 180tcaaattcca aaaataaaat ataataaccc aatatcttta tgatttgttg acc233實施例2 :引物PPZYF/PPZYR對雙鉤巢粉虱不同蟲態(tài)和性別的擴(kuò)增效果I)雙鉤巢粉虱模板DNA的制備將不同蟲態(tài)和性別的單頭/單粒雙鉤巢粉虱置于滴有20 提取緩沖液(50mMTr i s-HCl、I mM EDTA、l%SDS、20mMNaCl, pH 8.0)的 parafilm 膜上，以 0. 2mL 的 PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液以微量移液器移入I. 5mL離心管；然后以200 u L緩沖液分2次清洗勻漿器，移入同一離心管，混勻，加入5 y L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于60° C水浴Ih(中途混勻I次)；然后沸水浴8min，加入220iiL氯仿/異戊醇(V:V=24:1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min ;4° C、12000r/min離心20min，取上清液，加入440 L預(yù)冷的無水こ醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20° C放置30min;4° C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液。加入500 u L預(yù)冷的75%こ醇洗滌，4° C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后每管加入20 ii L超純水,充分溶解后于-40° C保存?zhèn)溆谩?)檢驗雙鉤巢粉虱的特異性引物的合成 Primer PPZYF 5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3'PrimerPPZYRj' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3'由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為20ii L，其中 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii L、dNTP (IOmM) 0. 4 ii L、Taq聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 15 ii L、上游引物和下游引物(IOuM)各0. 5 y L、模板DNA1. 0 y L、超純水 15. 45 u L04) PCR擴(kuò)增程序94。C 預(yù)變性 5min ;30 個循環(huán)94。C 30sec、61。C 30sec、72。C 40sec ;最后72。C 延伸 5min。
5) PCR產(chǎn)物的鑒定取3 ii L PCR產(chǎn)物用I. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化こ錠染色后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。結(jié)果利用引物PPZYF/PPZYR以不同蟲態(tài)和性別的雙鉤巢粉虱線粒體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。雙鉤巢粉虱的雌性成蟲和雄性成蟲均擴(kuò)增出了 233bp的目的條帶(見附圖2的7、6泳道)；同時雙鉤巢粉虱的單頭四齡若蟲、三齡幼蟲、ニ齡幼蟲、初孵若蟲以及單粒卵也擴(kuò)增出了 233bp的目的條帶(見附圖2的5、4、3、2、1泳道)，說明我們所篩選的雙鉤巢粉虱的種特異性SS-COI PCR擴(kuò)增弓I物的準(zhǔn)確性高。實施例3 :引物PPZYF/PPZYR對雙鉤巢粉虱檢測閾值的測定I)雙鉤巢粉虱模板DNA的制備 將單頭雙鉤巢粉虱雌性成蟲置于滴有20 ii L提取緩沖液(50mM Tris-HCl, ImMEDTA、l%SDS、20mMNaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液以微量移液器移入I. 5mL離心管；然后以200 y L緩沖液分2次清洗勻漿器，移入同一離心管，混勻，加入5 u L蛋白酶K(20mg/mL),充分混勻后于60° C水浴Ih(中途混勻I次)；然后沸水浴8min，加入220iiL氯仿/異戊醇(V:V=24:1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min ;4° C、12000r/min離心20min,取上清液,加入440 u L預(yù)冷的無水こ醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20° C放置30min ;4° C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液。カロ入500 ii L預(yù)冷的75%こ醇洗漆,4° C、12000r/min離心15min,小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后姆管加入20 y L超純水。原模板溶液稀釋為1/320頭后以2倍進(jìn)行遞減梯度稀釋至1/81920頭，取I y L作為PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。2)檢驗雙鉤巢粉虱的特異性引物的合成Primer PPZYF :5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3'PrimerPPZYRj' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3'由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為20ii L，其中 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii L、dNTP (IOmM) 0. 4 ii L、Taq聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 15 ii L、上游引物和下游引物(IOuM)各0. 5 y L、模板DNA1. 0 y L、超純水 15. 45 u L04) PCR擴(kuò)增程序94。C 預(yù)變性 5min ;30 個循環(huán)94。C 30sec、61。C 30sec、72。C 40sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR產(chǎn)物的鑒定取3 ii L PCR產(chǎn)物用I. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化こ錠染色后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。結(jié)果利用引物primer PPZYF/PPZYR做檢測閾值的測定，以不同稀釋倍數(shù)的雙鉤巢粉虱線粒體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能檢測到的最低模板DNA濃度為1/40960頭雌性成蟲(見附圖3)。
權(quán)利要求
1.一對雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物，其特征在于，所述引物序列為引物PPZYF :5'-TAAAGGAACTMTCAATTTCCMATCCC-3';和引物 PPZYR : 5' -GGTCMCAAATCATAMGATATTGGGT-3'。
2.雙鉤巢粉虱SS-COI特異性片段，其特征在于，所述片段的序列如SEQID No. 3所示。
3.—種雙鉤巢粉虱特異性檢測方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求I所述SS-COI引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
4.一種雙鉤巢粉虱特異性檢測方法，其特征在于，所述方法包括使用探針與權(quán)利要求2所述特異性片段進(jìn)行雜交的步驟。
5.一種雙鉤巢粉虱檢測特異性檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求I所述的雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物和/或用于檢測權(quán)利要求2所述特異性片段的探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一對雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物及快速PCR檢測方法和試劑盒。所述雙鉤巢粉虱特異性SS-COI引物為引物PPZYF5′-TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3′；和引物PPZYR5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3′。本方法根據(jù)雙鉤巢粉虱種特異性SS-COI標(biāo)記設(shè)計的引物PPZYF和PPZYR，在PCR快速檢測雙鉤巢粉虱時，可擴(kuò)增出233bp的片段，不僅對雙鉤巢粉虱的單頭成蟲和二齡、三齡、四齡若蟲可以進(jìn)行檢測，對于單粒卵和單頭初孵若蟲也能準(zhǔn)確檢測。
文檔編號C12N15/11GK102952882SQ201210420799
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者張桂芬, 萬方浩, 郭建洋, 郭建英, 劉萬學(xué), 曹鳳勤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所