達托霉素高產菌株及制備方法

專利名稱：達托霉素高產菌株及制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物制藥領域，具體涉及一種達托霉素高產菌株及其制備方法。
背景技術：
抗耐藥菌藥物是目前世界上藥物研究開發的重點和發展方向之一。達托霉素(Daptomycin,DAP)是近年第一個環脂肽類新型抗生素，其化學結構和作用機制不同于已有所有類別的抗生素，是近四十年來繼噁唑烷酮類抗生素后，應用到臨床的唯一新結構類別抗生素。達托霉素最初是由Lilly公司80年代末研究獲得，于1997年11月將DAP的全球獨家開發、生產銷售權轉讓給Cubist制藥公司開發的環脂肽類抗生素。2003年底，美國食品藥品監督管理局(FDA)經過快速審理程序批準注射用達托霉素(商品名Cubicin)用于治療金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株)、化膿性念球菌、無乳念球菌、停乳念球菌似馬亞種和糞腸球菌(萬古霉素敏感菌株)引起的復雜性皮膚及皮膚組織感染(cSSSI)。隨后也批準用于治療金黃色葡萄球菌引起的菌血癥(SAB)，包括甲氧西林敏感性金黃色葡萄 球菌(MSSA)和耐甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的右側感染性心內膜炎(RIE)。注射用達托霉素除2003年在美國上市外，還分別于2006年在奧地利、德國、荷蘭、西班牙、英國和2007年在瑞士上市。由于作用機制和結構上的差異，達托霉素在臨床上有著明顯的優勢，其前景非常可觀。達托霉素在2007年院區感染治療藥物市場上的銷售額達到2億美元，在以后數年內還有上升的潛力。隨著高致病耐藥菌，如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)等的不斷出現，臨床上對新抗生素的需求變得十分迫切。達托霉素除了能作用于大多數臨床相關革蘭氏陽性菌外，對以上耐藥菌均有很好的殺菌效果，毒副作用小。它的上市為臨床醫生提供了一種新的治療方案。迄今，我國還沒有研發具有自主知識產權的達托霉素藥品，只是在2009年進口Cubist公司的產品。國內中國科學院上海有機化學研究所和上海吉爾生化有限公司有機合成達托霉素獲得成功(專利申請號200710037006. 6)，但其合成工藝復雜、產品得率低，生產成本較高，不適宜達托霉素的工業化生產。而以Streptomyces Iividans為宿主構建基因工程菌，進行達托霉素的異源表達，表達水平(22mg/L)遠低于原菌株。進一步優化培養基中磷酸鹽水平，刪除產放線菌素的act基因簇以減輕宿主細胞的代謝負荷，提高外源基因表達水平，達托霉素產量最終可以達到55mg/L。由于受表達水平的制約，利用Streptomyces Iividans進行達托霉素的異源表達目前僅停留在實驗室研究階段。達托霉素異源表達水平距產業化要求尚有較大差距(Julia P, Xiang L，Whiting A, etal. Heterologous production of daptomycin in streptomyces lividans. Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology，2006，33 (2):121-128.)。

發明內容
本發明要解決的技術問題是目前達托霉素產量低，難以獲得的技術問題。本發明采用的解決上述技術問題的技術方案為提供一種玫瑰孢鏈霉菌Streptomycesroseosporus 的突變株，命名為 Streptomyces roseosporus SCU。本發明玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus的突變株是由申請人四川大學以玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL 11379株為出發菌株誘變得到,該突變株已于2012年07月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為玫瑰抱鏈霉菌 Streptomyces roseosporus,保藏號為 CGMCC No. 6356。其中，上述玫瑰孢鏈霉菌突變株Streptomyces roseosporus SQJ :具有高的達托霉素產量。
本發明還提供了一種制備上述的突變株Streptomyces roseosporus SQJ的方法。該方法包括以下步驟I)、對野生型玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)進行EMS/紫外復合誘變處理，涂布斜面，培養，得誘變處理突變株；2)分別將步驟I)所得的突變株斜面培養物制備孢子懸液，涂布含有達托霉素的固體平板，培養，即得耐受達托霉素的玫瑰孢鏈霉菌；3)、分別挑取步驟2)所得耐受達托霉素的玫瑰孢鏈霉菌單菌落進行搖瓶發酵培養，檢測發酵物中的達托霉素產量，選擇達托霉素產量比出發菌株高的菌株，得到了Streptomyces roseosporus SCU0本發明另外還提供了一種制備達托霉素的方法。該方法是以玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus的發酵菌液為原料分離純化得到達托霉素。其中，上述制備達托霉素的方法包括以下步驟收集發酵6 7d的玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus菌液,離心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl調節溶液pH3. 5 4. 5，用雙蒸水沖洗正丁醇，pH維持3. 5 4. 5 ;再加入雙蒸水并調節pH6. 5 7. 3 ;在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，與雙蒸水混合后，用HCl調節pH3. 5 4. 5，雙蒸水沖洗一次移除Ca2 + ;去除水相，將醇相與雙蒸水混合，以調節至PH7. 0，達托霉素以鈉鹽形式存在于水相中，除去正丁醇，獲得純度80%以上達托霉素粗提物。進一步的，上述方法的步驟為收集發酵6 7d的玫瑰孢鏈霉菌Streptomycesroseosporus菌液，離心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl調節溶液pH3. 5，用雙蒸水沖洗正丁醇，PH維持3. 5 ;再加入雙蒸水并調節pH7. 3 ;在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，與雙蒸水混合后，用HCl調節pH3. 5，雙蒸水沖洗一次，保持pH3. 5移除Ca2 + ;去除水相，將醇相與雙蒸水混合，以調節至pH7. 0，達托霉素以鈉鹽形式存在于水相中，除去正丁醇，獲得純度80%以上達托霉素粗提物。其中，上述制備達托霉素的方法還包括以下步驟將所述達托霉素粗提物再用硅膠柱層析色譜、陰離子交換樹脂或高效液相色譜進一步分離純化，最終得到純度90%以上的達托霉素制品。其中，上述制備達托霉素的方法中所述的玫瑰孢鏈霉菌Streptomycesroseosporus 為其突變株 Streptomyces roseosporus SCU0本發明采用微生物發酵轉化方法來生產DAP,即以Streptomyces roseosporus為出發菌株，經復合誘變處理和抗DAP篩選，通過對菌株的生長代謝條件的優化調控，最終選育出一株達托霉素產量達800-1000 μ g/ml的突變株Streptomyces roseosporus SQJ。并對發酵液的達托霉素分離提取、純化與體外活性檢測，獲得高純度和高活性的最終產品達
托霉素。本發明的有益效果在于本發明創造性地通過EMS/紫外復合誘變的方式獲得了一種玫瑰抱鏈霉菌 Streptomyces roseosporus 突變株 Streptomyces roseosporus SCU。該突變株能夠高效生產達托霉素，且培養方便，制備達托霉素的過程也較為簡便高效，能得到高純度的達托霉素，具有很好的應用前景。


圖I. P/oEMS溶液處理玫瑰孢鏈霉菌孢子不同時間的生長試驗。
圖2. EMS和UV復合誘變后突變株抗DAP的水平測試試驗。圖3.突變株發酵液抗菌性試驗結果。圖4.達托霉素標準品最小抑囷濃度(MIC)試驗結果。圖5.分離純化DAP的色譜圖(保留時間為3. 42min)。

發明內容
本發明玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus的突變株是由申請人四川大學以玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379株為出發菌株,通過EMS/紫外復合誘變的方式得到，該突變株已于2012年07月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus,保藏號為CGMCCNo. 6356。實施例一復合誘變玫瑰孢鏈霉菌I、EMS 誘變以玫瑰抱鏈霉菌(Streptomycesroseosporus) NRRL 11379 為出發菌株，NRRL 美國農業研究菌種保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)。經斜面培養14d的孢子，用滅菌生理鹽水洗下加入裝有玻璃珠的錐形瓶中，30°C，250rpm搖動處理2h，無菌紗布過濾，得到孢子懸液(I X IO6個/ml)。在50ml三角瓶內加入Iml孢子懸液、9ml磷酸緩沖液和0. Iml甲基磺酸乙酯(EMS)溶液，使EMS終濃度達到1%，30°C恒溫振蕩，分別處理一定時間(20 60min)。然后各取0. 5mI處理液,加入0. 5ml的5%硫代硫酸鈉溶液洗滌兩次終止反應，稀釋到2. 5 X IO3個孢子/ml后，取0. Iml涂布于ISP2分離培養基(其成分為酵母膏0. 4%，麥芽汁I %，葡萄糖0. 4%，瓊脂2 % ;所述的百分比均為質量體積百分比)，30°C培養2-3d后，不同誘變時間的孢子均能在平板長出菌落(圖I)。2、紫外線誘變采用經1%EMS溶液處理40min后生長出的單菌落，挑入ISP2斜面(其成分為酵母膏0. 4%，麥芽汁1%，葡萄糖0. 4%，瓊脂2% ;所述的百分比均為質量體積百分比)，斜面培養14d的孢子，用滅菌生理鹽水洗下加入裝有玻璃珠的錐形瓶中，30°C，250rpm搖動2h，無菌紗布過濾，得到孢子懸浮液并稀釋到I X IO6個/ml。取IOml孢子懸液于IOcm直徑的無菌平皿中，放入超凈臺內的水平搖床上，8w紫外燈下30cm處分別照射lmin, 2min, 4min,然后稀釋到2. 5X IO3個/ml,取O. Iml涂布于ISP2分離培養基，30°C培養10-12d可見單菌落長出。由于UV處理2分鐘的孢子存活率適中，故挑取處理2分鐘的單菌落接種到ISP2斜面培養12-14d，備用。3、復合誘變后菌株抗DAP水平測試將經過上述1，2復合誘變處理的2輪的突變株，分別劃線在含有100-2000 μ g/ml梯度濃度DAP的ISP2培養基斜面上，30°C培養10_14d可見菌落能在100-1000 μ g/ml DAP的培養基斜面生長良好，在1500 μ g/ml DAP的培養基斜面生長很差，在2000 μ g/ml DAP的培養基斜面不生長(見圖2)。 結果表明，經過EMS和UV的復合誘變，突變株抗自生代謝產物DAP的能力大大增強，故我們后續通過在含有1500 μ g/ml DAP的平板上涂布上述2中UV處理2分鐘的孢子，30°C培養10-14d，可見菌落長出。4、突變株的搖瓶發酵培養及發酵液抗菌性試驗4. I搖瓶培養直接從生長良好的平板挑取合適接種的菌落于裝有30ml種子培養基(TSB 30g,玉米淀粉35g，溶解于IL蒸餾水中，pH7. O)的250ml三角瓶中，30°C，200rpm搖床培養48h。按4% (體積比)的接種量將種子培養液轉接入裝有300ml發酵培養基(見表I，混勻，溶于IL水中，pH7. 5，培養基滅菌條件121°C，滅菌20min。)的IOOOml三角瓶中，30°C，200rpm搖床培養。從第24h后，每隔12h，向搖瓶中加入癸酸使其終濃度為O. 2g/L，每組三個搖瓶。自發酵培養4-10h后，每12h取樣測量發酵液中達托霉素的濃度及菌體濃度，以確定癸酸補加時間和發酵時間。表I.液體發酵培養基組成
玉米淀粉 20g 葡萄糖 20i 黃豆粉 20g 酵母浸粉 1 ~
MgS04O.175g
KCl02g
CaC032g4. 2發酵液抗菌性試驗收集發酵6-7d的菌液，4000rpm,離心20min，收集上清液，O. 22 μ m濾器過濾備用。抗菌性試驗步驟參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準文獻M07-A8微量肉湯稀釋法進行。測試菌株為金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC25923, ATCC為美國標準生物品收藏中心(American type culture collection)。達托霉素標準品最小抑菌濃度(MIC)為 O. 25 μ g/ml。
操作步驟I)用接種環挑取形態相似菌落3-5個,接種于4_5ml的Mueller-Hinton (MH)肉湯中，37°C孵育6-8h。增菌后的對數生長期菌液用生理鹽水校正濃度至O. 5麥氏比濁標準，并在此基礎上稀釋20倍，使菌液濃度約為5X 106CFU/ml。2)發酵液倍比稀釋，稀釋倍數為A，B, C，D，取96孔板按濃度梯度各加入稀釋液100 μ 1，每孔加入菌液10 μ 1，使菌液濃度約為5Χ 105CFU/ml，做好陽性及陰性對照，37°C孵育16-20h后觀察結果。
注MH肉湯需調節Ca2+濃度為50 μ g/ml。3)肉眼觀察或使用酶標儀在570nm測定96孔板各孔的OD值，與陽性對照比較，以無菌生長孔為有效抑菌濃度。4)達托霉素標準品最小抑囷濃度(MIC)如圖3 :如圖3所示，標準品濃度在O. 25-8 μ g/ml之間時孔內培養基OD值與陰性對照差異不大，肉眼觀察孔內培養基澄清無菌生長，而濃度低于O. 25 μ g/ml時孔內培養基OD值與陰性對照有顯著性差異(P〈0. 01)，肉眼觀察孔內培養基渾濁有大量菌體生長，則可以確定O. 25 μ g/ml為標準品對金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC25923的最小抑菌濃度。標準品對菌株金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC6538的最小抑菌濃度也為 O. 25 μ g/ml。 5 )突變株發酵液抗菌性試驗結果如圖4 如圖4所示，發酵液稀釋倍數在A-B之間時孔內培養基OD值與陰性對照差異不大，肉眼觀察孔內培養基澄清無菌生長，而稀釋倍數高于B時孔內培養基OD值與陰性對照有顯著性差異(P〈0.01)，肉眼觀察孔內培養基渾濁有大量菌體生長，則可以確定發酵液稀釋倍數B為對ATCC25923的最小有效抑菌濃度，根據多次重復結果推算該菌株的達托霉素粗品含量約為800-1000 μ g/ml，此菌株在搖瓶培養復篩中產量最高，命名為Str印tomycesroseosporus SCU0實施例二 DAP的分離純化收集上述菌株Streptomyces roseosporus SQJ在上述實施例中發酵6_7d的菌液270ml，4000rpm，離心20min，收集得到250ml上清液。用正丁醇連續萃取兩次，每次100ml，用lmol/LHCl調節溶液ρΗ3· 5 4. 5，優選3. 5，用30ml雙蒸水沖洗正丁醇，pH維持3. 5 4. 5，優選3. 5。加入IOOml雙蒸水，調節ρΗ6· 5 7. 3，優選7. 3，在水相中加入I. Og CaCl2用正丁醇萃取兩次，每次80ml。收集正丁醇萃取物，與等體積雙蒸水混合，用lmol/L HCl調節PH3. 5，15ml雙蒸水沖洗一次，保持pH3. 5移除Ca2 +。去除水相，醇相與50ml雙蒸水混合，以Imol/LNaOH調節pH7. O, A-21978C以鈉鹽形式存在于水相中。在真空下蒸干除去正丁醇，再凍干處理，獲得黃褐色樣品，純度約為83%。再利用硅膠柱層析色譜，陰離子交換樹脂或高效液相色譜(HPLC)進一步分離純化，最終得到純度達95%的達托霉素制品(見圖5)。
權利要求
1.玫瑰抱鏈霉菌Streptomyces roseosporus 的突變株 Streptomyces roseosporusSCU，其保藏號為 CGMCC No. 6356。
2.制備權利要求I所述的突變株Streptomycesroseosporus SQJ的方法,其特征在于包括以下步驟 1)、對野生型玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)進行甲基磺酸乙酯(EMS) /紫外復合誘變處理，涂布斜面，培養，得誘變處理突變株；2)分別將步驟I)所得的突變株斜面培養物制備孢子懸液，涂布含有達托霉素的固體平板，培養，即得耐受達托霉素的玫瑰孢鏈霉菌；3)、分別挑取步驟2)所得耐受達托霉素的玫瑰孢鏈霉菌單菌落進行搖瓶發酵培養，檢測發酵物中的達托霉素產量，選擇達托霉素產量比出發菌株高的菌株，得到了Streptomyces roseosporus SCU0
3.制備達托霉素的方法，其特征在于以發酵6 7天的玫瑰孢鏈霉菌Streptomycesroseosporus菌液為原料分離純化得到達托霉素。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步驟收集發酵6 7天的玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus菌液,離心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl調節溶液PH 3. 5 4. 5，用雙蒸水沖洗正丁醇，pH維持3. 5 4. 5 ;再加入雙蒸水并調節PH6. 5 7. 3 ;在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，與雙蒸水混合后，用HCl調節pH3. 5 4. 5，雙蒸水沖洗一次移除Ca2 + ;去除水相，將醇相與雙蒸水混合，以調節至PH7.0，達托霉素以鈉鹽形式存在于水相中，除去正丁醇，獲得純度80%以上達托霉素粗提物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于包括以下步驟收集發酵6 7天的玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus菌液,離心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl調節溶液PH3. 5，用雙蒸水沖洗正丁醇，pH維持3. 5 ;再加入雙蒸水并調節pH7. 3 ;在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，與雙蒸水混合后，用HCl調節pH3. 5，雙蒸水沖洗一次，保持PH3. 5移除Ca2+ ;去除水相，將醇相與雙蒸水混合，以調節至pH7. 0，達托霉素以鈉鹽形式存在于水相中，除去正丁醇，獲得純度80%以上達托霉素粗提物。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于還包括以下步驟將所述達托霉素粗提物再用硅膠柱層析色譜、陰離子交換樹脂或高效液相色譜進一步分離純化，最終得到純度90%以上的達托霉素制品。
7.根據權利要求3 6任一項所述的方法，其特征在于所述的玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus 為其突變株 Streptomyces roseosporus SCU0
全文摘要
本發明屬于微生物制藥領域，具體涉及一種達托霉素高產菌株及其制備方法。本發明要解決的技術問題是目前達托霉素產量低，難以獲得的技術問題。本發明采用的解決上述技術問題的方案是提供一種玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus的突變株，命名為Streptomyces roseosporus SCU，保藏號為CGMCC No.6356。該突變株能夠高效生產達托霉素，且培養方便，制備達托霉素的過程也較為簡便高效，能得到高純度的達托霉素，在微生物制藥工業上具有良好的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102965304SQ20121042071
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月29日 優先權日2011年10月27日
發明者梁淑芳, 李國順, 馬雯, 李蓉暉 申請人:四川大學